• Specialitāte HAC RF03.00.23
• Lapu skaits 106

II. LITERATŪRAS APSKATS.

1. nodaļa. NATĪVO UN REKOMBINĀTO PEROKSIDĀŽU STRUKTŪRA, DARBĪBAS MEHĀNISMS UN JAUNI PIELIETOJUMS.

1.1. Ievads.

1.2. Peroksidāžu kristāliskās struktūras.

1.3. Peroksidāžu skābju bāzes katalīze.

1.4. Metāla saistīšanas vietas.

1.5. HRP aktīvā centra arhitektūra.

1.5.1. HRP distālā reģiona struktūra un ūdeņraža saišu sistēma.

1.5.2. HRP proksimālā reģiona struktūra un ūdeņraža saišu sistēma.

1.5.3. Iesiešanas vieta aromātiskām substrātiem.

1.6. Olbaltumvielu vides loma peroksidāzes katalīzē.

2. nodaļa. PEROKSIDĀŽU BIOTEHNOLOĢISKIE PIELIETOJUMS.

2.1. Peroksidāžu izmantošana dushunoenzīmu analīzē.

2.2. Fizioloģiski aktīvo vielu bioķīmiskā analīze.

2.3. Peroksidāžu izmantošana biosensoros.

2.4. Peroksidāžu pielietojums biotransformācijās.

2.5. Peroksidāžu izmantošana biobalināšanai celulozes un papīra rūpniecībā.

3. nodaļa

E. coli ŠŪNĀS IZSKURSOTĀS EUKARIOTOS PROTEĪNU DIULFĪDSAITES IEKĻAUŠANAS ĶERMENĪS.

III. EKSPERIMENTĀLĀ DAĻA.

4. nodaļa. MATERIĀLI UN METODES.

4.1. Reaģenti.

4.2. Pētījuma metodes.

4.2.1. HRP rekombinanto formu klonēšana.

4.2.2. HRP rekombinantā konjugāta iegūšana ar BPFA.

4.2.3. Rekombinantās HRP ekspresija E. coli šūnās.

4.2.4. Rekombinantās HRP pārlocīšanas un attīrīšanas protokoli.

4.2.5. HRP rekombinanto formu fizikāli ķīmiskās īpašības.

4.2.6. Adsorbcijas un elektroķīmiskie mērījumi.

4.2.7. Strukturālo izmaiņu aprēķins mārrutku peroksidāzes mutācijas formās.

IV. REZULTĀTI UN TO Diskusija.

5. nodaļa. REKOMBINĀTĀS ZIRZZIRKU PEROKSIDĀZES IZTEIKŠANA

E.coli ŠŪNĀS: IZTEIKŠANAS, PĀRKOLĪŠANAS, REAKTIVĀCIJAS UN ATTĪRĪŠANAS SISTĒMAS OPTIMIZĀCIJA.

5.1. HRP ekspresija E. coli BL21(DE3) šūnu periplazmatiskajā reģionā.

5.2. HRP pārlocīšanas sistēmas optimizācija no ieslēguma ķermeņiem, ekspresējot E. coli BL21(DE3)pLysS šūnu citoplazmas reģionā.

5.3. Rekombinantā PCS 6xHis īpašības C-galā.

5.4. HRP mutantu formu iegūšana un īpašības.

6. nodaļa. AMPEROMETRISKIE SENSORI, KAS BALSTĪTIES UZ

REKOMBINĀTĀS HRP FORMAS.

6.1. H2O2 amperometriskā noteikšana.

6.2. Biosensora signāla stabilitāte.

6.3. Bienzimātisko biosensoru izstrāde.

7. nodaļa. REKOMBINANTĀ KONJUGĀTA SAGATAVOŠANA UN ĪPAŠĪBAS

MIRKU PEROKSIDAZE AR BPFA.

7.1. Rekombinantā HRP-PAFA konjugāta klonēšana un ekspresija E. coli šūnās.

7.2. Rekombinantā HRP-BPFA konjugāta fizikāli ķīmiskās un imunoloģiskās īpašības.

V. SECINĀJUMI

Ieteicamais disertāciju saraksts

• Ar enzīmu saistīts imūnsorbcijas tests proteīnam, kas saista taukskābes, pamatojoties uz rekombinantiem reaģentiem 2004, ķīmijas zinātņu kandidāte Andrejeva, Irina Petrovna

• Rekombinantā tabakas peroksidāze: sagatavošana un katalītiskās īpašības 2007, ķīmijas zinātņu kandidāts Khushpulyan, Dmitrijs Mihailovičs

• Rekombinanto cilvēka proteīnu ar potenciālu pretvēža efektu radīšana un īpašību izpēte 2007, ķīmijas zinātņu kandidāte Savvateeva, Ludmila Vladimirovna

• Konformācijas atšķirības starp mārrutku peroksidāzes izoenzīma C vietējām un rekombinantajām formām, kas noteiktas ar radioķīmiskām un kinētiskām metodēm

• Baktēriju uridīna fosforilāžu fosfātus saistošā reģiona organizācijas izpēte 2000, bioloģijas zinātņu kandidāts Čebotajevs Dmitrijs Vladimirovičs

Ievads promocijas darbā (kopsavilkuma daļa) par tēmu "Rekombinantās mārrutku peroksidāzes iegūšana, īpašības un pielietošana"

Līdzīgas tēzes specialitātē "Biotehnoloģija", 03.00.23 VAK kods

• Konformācijas atšķirības starp mārrutku peroksidāzes izoenzīma C vietējām un rekombinantajām formām, kas noteiktas ar radioķīmiskām un kinētiskām metodēm 2002, ķīmijas zinātņu kandidāte Čubara, Tatjana Anatoljevna

• Rekombinantie glutaril-7-aminocefalosporānskābes acilāzes analogi no baktērijas Brevundimonas diminuta 2009, bioloģijas zinātņu kandidāte Zakirova, Svetlana Anatoljevna

• Rietumsibīrijas Borrelia burgdorferi sensu lato izolātu rekombinanto proteīnu iegūšana un to antigēno īpašību izpēte 2009, bioloģijas zinātņu kandidāts Rjabčenko, Aleksandrs Vladimirovičs

• TRAIL citokīna pretvēža aktivitātes palielināšana, mainot proteīna aminoskābju sastāvu 2010, bioloģijas zinātņu kandidāte Jagoloviča, Anna Valerievna

• Beta-spirālveida domēna un peptidil-prolilizomerāzes izmantošana, lai iegūtu bakteriofāga T4 fibrilāro adhezīnu 2012, bioloģijas zinātņu kandidāts Čuprovs-Netočins, Romāns Nikolajevičs

Promocijas darba noslēgums par tēmu "Biotehnoloģija", Grigorenko, Vitālijs Georgijevičs

Atsauču saraksts disertācijas pētījumam ķīmijas zinātņu kandidāts Grigorenko, Vitālijs Georgijevičs, 2001

Lūdzu, ņemiet vērā, ka iepriekš minētie zinātniskie teksti tiek publicēti pārskatīšanai un iegūti, izmantojot oriģinālo disertācijas teksta atpazīšanu (OCR). Šajā sakarā tajos var būt kļūdas, kas saistītas ar atpazīšanas algoritmu nepilnībām. Mūsu piegādātajos disertāciju un kopsavilkumu PDF failos šādu kļūdu nav.

Metode ietver diedzēto mārrutku sakņu samalšanu un homogenizāciju, mārrutku sakņu homogenizāta ekstrakciju ar 0,15±0,01 M nātrija hlorīda šķīdumu. Balasta olbaltumvielas tiek atdalītas un peroksidāze tiek izgulsnēta ar amonija sulfāta sāļiem ar piesātinājumu attiecīgi 45-48% un 85-90%. Peroksidāzes šķīduma gēla filtrēšanu veic uz Sephadex G-100, eluējot ar 0,15-0,2 M nātrija hlorīda šķīdumu. Karboksimetilcelulozes hromatogrāfisko attīrīšanu veic. Tiek veikta mērķa peroksidāzes liofilizēšana. Dialīzi veic pret nātrija acetāta buferšķīdumu ar pH 4,4-5,0 un dialīzi pret kālija fosfāta buferšķīdumu ar pH 8,0±0,1. Veic koncentrēšanu ar turpmāku attīrīšanu uz DEAE-celulozes, eluējot ar to pašu buferšķīdumu, kam seko dialīzes pret dejonizētu ūdeni. Metode ļauj iegūt peroksidāzi ar augstu īpatnējo aktivitāti un augstu ražu. Peroksidāzes izvade ir 2,52-3,50 g/kg mārrutku sakņu, īpatnējā aktivitāte ir 640-700 EA/mg proteīna. 5 z.p. f-ly, 2 ill., 1 tab.

RF patenta 2353652 rasējumi

Izgudrojums attiecas uz biotehnoloģijas jomu, proti, enzīmu ražošanu no augu izejvielām, un to var izmantot enzīma peroksidāzes laboratoriskai un rūpnieciskai ražošanai no mārrutku saknēm imunoloģijai un imūnķīmijai kā enzīmu imūnanalīžu konjugātu galvenā sastāvdaļa.

Ir zināmas dažādas metodes peroksidāzes iegūšanai no mārrutku saknēm.

Zināma metode peroksidāzes iegūšanai no mārrutku saknēm, tostarp mārrutku sakņu homogenizācija, enzīma ekstrakcija ar fizioloģisko šķīdumu, fermenta izgulsnēšana ar amonija sulfāta sāļiem, gēla filtrēšana, spirta izgulsnēšana, elektroforēze, atkārtota izgulsnēšana ar amonija hlorīdu, filtrēšana caur Sephadex G- 50 un DEAE-celuloze un dialīze.

Šīs metodes galvenie trūkumi ir iegūtā produkta zemā aktivitāte un tīrība, kā arī tā ražošanas sarežģītība un liels tehnoloģiskā procesa posmu skaits.

Ir zināms arī paņēmiens peroksidāzes iegūšanai no mārrutku saknēm, kurā mārrutku saknes homogenizē, pēc tam enzīmu ekstrahē ar ūdeni un peroksidāzi izgulsnē ar amonija sulfāta sāļiem, kam seko gēla filtrēšana [ASV Pat. Ungārija 172872, C07G 7/022].

Šīs metodes trūkums ir zemā fermenta raža un zemā tīrība.

Zināma metode [A.S. Bulgārija 46675, C12N 9/08, 15.02.90], saskaņā ar kuru mārrutku saknes diedzē 2-3 dienas, pēc tam homogenizē un dienu fermentu ekstrahē ar ūdeni. Ūdens ekstraktu centrifugē, pēc tam veic proteīna frakcionēšanu ar amonija sulfāta sāļiem, tad fermenta amonija sulfāta nogulsnes izšķīdina destilētā ūdenī un pakļauj ultrafiltrācijai uz Milipor PTGC 000 05 filtriem. Pievieno 0,5 M fosfāta buferšķīdumu (pH 8). iegūto filtrātu proporcijā 100 daļas bufera uz 1 daļu filtrāta un izlaiž caur kolonnu ar jonu apmainītāju DEAE-Sephadex A-50, pēc tam secīgi ultrafiltrē uz Milipor PTGC 000 05, RTNK 000 05, PTGC 000 05 un pakļauti liofilizētai žāvēšanai.

Šīs metodes trūkums ir nepietiekami augsta peroksidāzes raža, augsta darba intensitāte un procesa ilgums.

Vistuvākais ir ceļš [US Pat. RF 2130070, C12N 9/08, 10.05.1999.], kurā ar ūdeni mazgātās mārrutku saknes attīra par 1/3 masas 0,25% pārtikas askorbīnskābes šķīduma klātbūtnē, ko izmanto kā ekstrakcijas šķīdumu. Peroksidāzi no attīrījumiem 1 stundu ekstrahē ar 0,25% askorbīnskābes šķīdumu, pēc tam ekstraktu filtrē un centrifugē. Supernatantam pievieno 5% nātrija sulfītu un 24 stundas tur istabas temperatūrā, lai ferments "nobriest". "Nogatavinātais" enzīmu šķīdums ir koncentrēts uz ultrafiltrācijas šķiedru ierīcēm ar filtriem, kuru poru diametrs ir mazāks par 40 kDa. Amonija sulfātu pievieno 10 reizes koncentrētam šķīdumam līdz galīgajam piesātinājumam 85-90%, centrifugē, nogulsnes izšķīdina desmitkārtīgā tilpumā divreiz destilēta ūdens un uzliek kolonnā, kas piepildīta ar Sephadex G-25, eluēšanu veic ar bidestilēts ūdens. Savākt frakcijas, kas satur peroksidāzi ar R Z >0,1. Savāktajām frakcijām pievieno amonija sulfātu līdz piesātinājumam 85-90%, centrifugē, nogulsnes izšķīdina 3-kārtīgā daudzumā bidestilēta ūdens un uzliek gēlfiltrācijas kolonnā, kas pildīta ar Sephadex G-50, eluēšanu veic ar bidestilēts ūdens. Savākt frakcijas, kas satur peroksidāzi, ar RZ vērtību >0,5. Frakcijas sajauc, titrē līdz pH 4,4 un pakļauj attīrīšanai uz karboksimetilcelulozes, fermentu eluē koncentrācijas gradientā no 5 mm līdz 0,15 M acetāta buferšķīdumam (pH 4,4) (V=S-500 ml, R-500 ml) . Savākt frakcijas ar RZ vērtību >2,7 un ar fermentu koncentrāciju vismaz 10 mg/ml. Frakcijas apvieno, titrē līdz pH 5,0 un liofilizē.

Šīs metodes trūkumi ir nepietiekami augsta tīrība un aktivitāte, kā arī zema peroksidāzes izvade.

Izgudrojums atrisina problēmu izveidot rūpniecisku metodi peroksidāzes iegūšanai no mārrutku saknēm, kas ļauj iegūt peroksidāzi ar augstu tīrību, augstu īpatnējo aktivitāti un augstu ražu.

Problēma tiek atrisināta ar peroksidāzes enzīma iegūšanas metodi no mārrutku saknēm, kas ietver diedzēto mārrutku sakņu sasmalcināšanu un homogenizāciju, mārrutku sakņu homogenizāta ekstrakciju, balasta proteīnu atdalīšanu un peroksidāzes izgulsnēšanu ar amonija sulfāta sāļiem, peroksidāzes filtrēšanu ar gēlu. šķīdums uz Sephadex, hromatogrāfiska attīrīšana uz karboksimetilcelulozes, mērķa peroksidāzes liofilizēšana, savukārt sasmalcinātas mārrutku saknes ekstrahē ar 0,15±0,01 M nātrija hlorīda šķīdumu ar pH=4,4±0,2; peroksidāzes šķīduma gēla filtrāciju veic uz Sephadex G-100 ar eluāciju ar 0,15-0,2 M nātrija hlorīda šķīdumu ar pH 4,4-5,0, dialīzi veic pret nātrija acetāta buferšķīdumu ar pH 4,4-5,0 un dialīzi pret kālija fosfāta buferšķīdumu ar pH 8,0. 0,1 un koncentrācija ar turpmāku attīrīšanu uz DEAE-celulozes, eluējot ar to pašu buferšķīdumu, kam seko dialīze pret dejonizētu ūdeni.

Olbaltumvielu izgulsnēšanu ar amonija sulfāta sāļiem izmanto divas reizes: balasta proteīnu atdalīšanai izmanto 45-48% piesātinājumu, un peroksidāzes izgulsnēšanai izmanto 85-90% piesātinājumu,

Pirms peroksidāzes hromatogrāfiskās attīrīšanas uz karboksimetilcelulozes veic dialīzi pret nātrija acetāta buferšķīdumu pH 4,4-5,0.

Pirms žāvēšanas liofilizē peroksidāzes šķīduma dialīzi pret dejonizētu ūdeni.

1. attēlā parādīta shematiska diagramma peroksidāzes izdalīšanai no mārrutku saknēm.

Mārrutku saknes mazgā zem tekoša ūdens un diedzē 140-160 stundas +25±1°C temperatūrā. Diedzētas saknes sasmalcina un ekstrahē ar 0,15 M nātrija hlorīda šķīdumu 12±2 stundas, nepārtraukti maisot, pēc tam centrifugē.

Nepārtraukti maisot, supernatantam-1 (1. attēls) pievieno 16,7 ± 0,05 kg (45-48% piesātinājums) amonija sulfāta, nogulsnes atdala ar centrifugēšanu un vēl 11,8 ± 0,05 kg (85% piesātinājums) amonija. sulfātu, nogulsnes (1. attēls) atdala ar centrifugēšanu un izšķīdina ar destilētu ūdeni līdz galīgajam tilpumam 200±10 ml. Pēc centrifugēšanas supernatantu, kas satur peroksidāzi, uzklāj kolonnā, kas piepildīta ar Sephadex G-100, un eluē ar 0,15 M nātrija hlorīda šķīdumu ar ātrumu 100 ml/h; eluēšanas laikā tiek ņemtas 20 ml frakcijas. Savāktās frakcijas mēra RZ =D 408/D 275 . Frakcijas, kurās R Z nav mazākas par 0,8, apvieno un dializē pret nātrija acetāta buferšķīdumu (pH 4,4 ± 0,2) (buferis-1), pēc tam atsāļoto peroksidāzes šķīdumu uzklāj uz kolonnas, kas pildīta ar karboksimetilcelulozi un līdzsvarota ar buferšķīdumu-1, un eluē ar lineāro gradientu 5 mm - 0,1 M acetāta buferšķīdums (pH 4,4±0,2) (V=S-0,5 l, R-0,5 l). Olbaltumvielu frakcijās izmēra Rz vērtību. Frakcijas, kurās R Z vērtība nav mazāka par 2,5, apvieno un dializē pret kālija fosfāta buferšķīdumu (pH 8,0 ± 0,1) (buferis-2), dializēto enzīmu šķīdumu klāj uz kolonnas, kas piepildīta ar DEAE-celulozi, un eluē buferi. -2. Frakcijas, kurās RZ vērtība nav mazāka par 3,0, apvieno un dializē pret dejonizētu ūdeni, pēc tam pārnes sterilā karstumizturīgā kolbā, sasaldē ar šķidru slāpekli un liofilizē, līdz zāles ir pilnīgi sausas.

Piedāvātās bioloģiski aktīvo vielu iegūšanas metodes būtiskās atšķirības pazīmes ir:

Gēla filtrācijas izmantošana uz Sephadex G-100 vispilnīgākai peroksidāzes attīrīšanai no zemas molekulmasas piemaisījumiem;

Dialīze pret nātrija acetāta buferšķīdumu (pH 4,4-5,0), kas ļauj atsālīt peroksidāzes šķīdumu un sagatavot to hromatogrāfijai uz karboksimetilcelulozes;

Dialīze pret kālija fosfāta buferšķīdumu (pH 8,0 ± 0,1), kas ļauj pārnest peroksidāzes šķīdumu optimālā buferšķīdumā ar optimālu pH, lai to lietotu uz DEAE-celulozes;

Peroksidāzes jonu apmaiņas hromatogrāfija uz DEAE-celulozes kā metode, kas nodrošina ne tikai papildu attīrīšanu, bet arī fermenta šķīduma koncentrēšanu.

Tādējādi mēs piedāvājam jaunu pieeju, kas ļauj apstrādāt mārrutku saknes ar augstas tīrības pakāpes un specifiskas aktivitātes peroksidāzes enzīma ražošanu.

Piedāvātās metodes atšķirība no tuvākā analoga un prototipa ir šāda.

Pieminētajā metodē sasmalcinātas mārrutku saknes ekstrahē ar 0,15±0,01 M nātrija hlorīda šķīdumu ar pH=4,4±0,2, tādējādi panākot vispilnīgāko fermenta pāreju šķīdumā, fermentam nezaudējot savu aktivitāti.

Izgudrojuma analogā [ASV Pat. RF 2130070, C12N 9/08, 05/10/1999] attīrīšanas peroksidāzi (bez homogenizācijas!) ekstrahē 1 stundu ar 0,25% pārtikas askorbīnskābes šķīdumu, kas var ietekmēt peroksidāzes iznākumu, jo attīrīšanas netiek homogenizētas. , un tāpēc ferments ne tuvu pilnībā nonāk šķīdumā, savukārt ekstrakcija notiek skābos apstākļos, kas var izraisīt fermenta daļēju inaktivāciju. Izgudrojuma prototipā [A.S. Bulgārija 46675, C12N 9/08, 15.02.90] mārrutku sakņu homogenizētā enzīmu ekstrahē ar ūdeni, kas arī rada zemu peroksidāzes iznākumu no homogenizētā šķīduma.

Atšķirībā no izgudrojuma analoga, kur peroksidāze tiek izgulsnēta divas reizes ar 85-90% piesātinājumu ar amonija sulfātu, un izgudrojuma prototipam, kur olbaltumvielas tiek izgulsnētas četras reizes ar amonija sulfāta sāļiem, pretenzijā norādītajā metodē tiek atdalīta balasta proteīnus veic ar 45-48% piesātinājumu, un pēc tam tiek izgulsnēta peroksidāze 85. % piesātinājums.

Izgudrojuma analogā un prototipā koncentrāciju veic ar ultrafiltrāciju, savukārt izgudrojuma analogā ultrafiltrācija notiek pirms peroksidāzes nogulsnēšanas ar amonija sulfātu, kas rada lielu piemaisījumu proteīnu līdzizgulsnēšanās iespējamību un attiecīgi. , lai gala produkta tīrība būtu zemāka. Pieprasītajā metodē tehnoloģiskā procesa beigu posmā peroksidāze tiek pakļauta koncentrācijai uz DEAE-celulozes jonu apmaiņas sorbenta, kas arī noved pie enzīma papildu attīrīšanas.

Pieprasītajā metodē gēla filtrēšanu veic uz Sephadex G-100, eluējot ar 0,15 ± 0,01 M nātrija hlorīda šķīdumu (pH 4,4-5,0), kas ļauj pilnībā atbrīvoties no peroksidāzes šķīduma zaļganās nokrāsas. hlorofila un radniecīgu savienojumu klātbūtne, kā arī vielas ar mazāku molekulāro izmēru nekā peroksidāzes. Izgudrojuma analogā gēla filtrēšana tiek veikta uz Sephadex G-25, kas, ņemot vērā peroksidāzes molekulas lielumu (apmēram 40 kDa), ir zemāka par Sephadex G-100 spēju aizturēt piemaisījumu daļiņas. .

Izgudrojuma būtību ilustrē šādi piemēri.

1. piemērs Rupja ekstrakta sagatavošana

50 kg mārrutku sakņu nomazgā zem tekoša ūdens un diedzē 140-160 stundas +25±1°C temperatūrā. Sadīgušas saknes sasmalcina uz lāpstiņu homogenizatora un ielej 50 l 0,15-0,2 M nātrija hlorīda šķīduma (pH 4,4±0,2). Suspensiju ekstrahē 12±2 stundas, nepārtraukti maisot, pēc tam centrifugē.

Amonija sulfātu pievieno supernatantam-1 ar tilpumu 60 l, lai atdalītu balasta proteīnus, nepārtraukti maisot līdz 45-48% piesātinājumam. (Ar 100% piesātinājumu saprot sāls daudzumu, kuru pievienojot šķīdums kļūst piesātināts, un pēc turpmākas sāls pievienošanas šķīdums kļūst pārsātināts, un sāls izgulsnējas. Šķīdumiem ar amonija sulfātu 100% piesātinājums ir pievienošana un pilnīga 70,7 g amonija sulfāta izšķīdināšana 100 ml destilēta ūdens.) Nogulsnes-1 atdala ar centrifugēšanu. Pēc tam iegūtais supernatants-2 ar tilpumu 55 l, lai izgulsnētu peroksidāzi, tiek piesātināts ar amonija sulfātu līdz 85%, nogulsnes-2 atdala ar centrifugēšanu. Iegūtās nogulsnes-2 izšķīdina ar dejonizētu ūdeni līdz galīgajam tilpumam 200±10 ml, neizšķīdušās nogulsnes-3 atdala ar centrifugēšanu.

Gēla hromatogrāfija uz Sephadex G-100.

Peroksidāzes šķīdumu uzklāj uz 1 l kolonnas, kas piepildīta ar Sephadex G-100. Eluciju veic ar 0,15-0,2 M nātrija hlorīda šķīdumu (pH 4,4-5,0) ar ātrumu 100 ml/h, eluēšanas laikā tiek ņemtas 20 ml frakcijas. Savāktās frakcijas mēra RZ =D 408/D 275 . Frakcijas, kurās R Z nav mazāks par 0,8, apvieno.

Kolekcijā ievieto 5 l 5±0,1 mm nātrija acetāta buferšķīduma (pH 4,4-5,0) (buferis-1) un dialīzes maisu ar kombinētām peroksidāzes frakcijām. Dialīzi veic, nepārtraukti maisot 24 stundas, trīs reizes mainot buferšķīdumu kolekcijā.

Atsāļotais enzīma šķīdums tiek uzklāts uz 1 litra kolonnas, kas piepildīta ar karboksimetilcelulozi un līdzsvarota ar buferšķīdumu-1. Eluciju veic ar ātrumu 50 ml/h lineārā gradientā 5 mm-0,1 M acetāta buferšķīdumā (pH 4,4±0,2) (V=S-0,5 l, R-0,5 l). Olbaltumvielu frakcijās izmēra Rz vērtību. Frakcijas, kurās RZ vērtība nav mazāka par 2,5, tiek apvienotas.

Kolekcijā ievieto 5 l 20 ± 0,1 mM kālija fosfāta buferšķīduma (pH 8,0 ± 0,1) (buferis-2) un dialīzes maisu ar apvienotām enzīmu frakcijām. Dialīze tiek veikta tādā pašā veidā.

Koncentrācijas hromatogrāfija uz DEAE-celulozes.

Enzīmu šķīdumu ar pH 8,0 ± 0,1 uzklāj uz 300 ml kolonnas, kas piepildīta ar DEAE-celulozi. Eluciju veic ar buferšķīdumu-2 ar ātrumu 50 ml/h. Frakcijas, kurās RZ vērtība nav mazāka par 3,0, tiek apvienotas.

Kolektorā ievieto 5 l dejonizēta ūdens un dialīzes maisu ar peroksidāzes šķīdumu. Dialīze tiek veikta tādā pašā veidā.

Saldēšanas žāvēšana.

Peroksidāzes šķīdumu pārnes sterilā karstumizturīgā kolbā, sasaldē ar šķidru slāpekli un žāvē liofilizētā veidā, līdz zāles ir pilnībā izžuvušas.

2. piemērs (salīdzinošs)

Šajā piemērā tiek saglabāti nosacījumi peroksidāzes iegūšanai atbilstoši prototipam, bet, lai uzlabotu peroksidāzes galvenos rādītājus, tiek mainīti divi prototipā esošie posmi, proti: peroksidāzes šķīduma ultrafiltrācijas koncentrācijai, divu veidu kolonnas ar dobu. tiek izmantotas šķiedras, atšķirībā no prototipa, kur tiek izmantotas viena veida šķiedras, un proteīnu frakcionēta frakcionēšana ar amonija sulfāta sāļiem (kā norādītajā metodē).

Rupja ekstrakta iegūšana.

50 kg mārrutku sakņu nomazgā zem tekoša ūdens un notīra ar 1/3 masas 33,5 l 0,25% ēdamās askorbīnskābes šķīduma klātbūtnē, kurā iegūtās attīrīšanas notur 1 stundu, lai ekstrahētu peroksidāzes enzīmu. . Pēc tam ekstraktu centrifugē plūsmas centrifūgā un inkubē 24 stundas fermenta "nogatavināšanai".

Primārā attīrīšana un koncentrēšana.

Iegūtajam ekstraktam pievieno 1,7 kg (5% no svara) nātrija sulfīta, un ekstraktu pakļauj koncentrēšanai un primārajai attīrīšanai ar ultrafiltrāciju UPV-6 dobās polimēra šķiedras blokā, kas aprīkots ar kolonnām ar filtriem ar poru izmēru 60 kDa. un 5 kDa. Uzstādīšanas shematiska diagramma ir parādīta 2. attēlā, kurā parādīts centrbēdzes sūknis 1; priekšfiltrs 2; kolonna ar šķiedrām, kuru poru izmērs ir 60 kDa 3; kolonna ar šķiedrām, kuru poru izmērs ir 5 kDa 4; peroksidāzes filtrāts 5; koncentrēts peroksidāzes 6 šķīdums; filtrāts, kas satur zemas molekulmasas proteīnus 7.

Olbaltumvielu frakcionēšana ar amonija sulfāta sāļiem.

Koncentrātam pievieno amonija sulfātu ar tilpumu 6 l, lai atdalītu balasta proteīnus, nepārtraukti maisot līdz 45-48% piesātinājumam. Nogulsnes atdala ar centrifugēšanu. Pēc tam iegūto supernatantu ar tilpumu 5,7 l, lai izgulsnētu peroksidāzi, piesātina ar amonija sulfātu līdz 85%, nogulsnes atdala ar centrifugēšanu, ko izšķīdina ar bidestilētu ūdeni līdz galīgajam tilpumam 200±10 ml, neizšķīdušās nogulsnes atdala ar centrifugēšanu.

Gēla hromatogrāfija uz Sephadex G-25 un G-50.

Turpmāka peroksidāzes attīrīšana tiek veikta gēla filtrēšanas kolonnā, kas pildīta ar Sephadex G-25 un līdzsvarota ar bidestilētu ūdeni. Peroksidāzes šķīdumu uzklāj uz kolonnas, eluēšanu veic ar bidestilētu ūdeni. Savāc frakcijas, kurās R Z nav mazāks par 0,2. Savāktajām frakcijām pievieno amonija sulfātu līdz 90% piesātinājumam, maisa, līdz sāls pilnībā izšķīst, un centrifugē. Nogulsnes izšķīdina 3 reizes vairāk destilēta ūdens un ievieto gēla filtrēšanas kolonnā, kas piepildīta ar Sephadex G-50 un līdzsvarota ar bidestilētu ūdeni. Eluciju veic ar bidestilētu ūdeni. Savāc frakcijas, kurās R Z nav mazāks par 0,6. Ar 50% etiķskābi peroksidāzes frakciju pH tiek noregulēts uz 4,4.

Hromatogrāfija uz karboksimetilcelulozes.

Peroksidāzes frakcijas tiek uzklātas uz 1 litra kolonnas, kas piepildīta ar karboksimetilcelulozi, kas iepriekš līdzsvarota ar 5 mM acetāta buferšķīdumu pH 4,4. Eluciju veic ar lineāro gradientu 5 mm-0,15 M acetāta buferšķīdumā (pH 4,4±0,2) (V=S-0,5 l, R-0,5 l) 1 stundu. Olbaltumvielu frakcijās izmēra Rz vērtību. Frakcijas, kurās R Z vērtība nav mazāka par 2,7, apvieno, noregulē līdz pH 5,0, pievienojot amonjaku, un liofilizē.

Salīdzinošie dati, piemēram, 1. un 2., ir parādīti tabulā.

Tādējādi, kā redzams no piemēriem un tabulas, pieprasītā metode peroksidāzes iegūšanai no mārrutku saknēm (1. piemērs) ļauj iegūt peroksidāzi ar augstu ražu, ar tīrību un aktivitāti, kas ir pietiekama, lai šo fermentu izmantotu kā neatņemamu sastāvdaļu. konjugāti fermentu imūntestiem. Un prototipa apstākļos (2. piemērs), pat uzlabojot divus posmus, kas uzlabo veiktspēju, mērķa peroksidāzes iznākums, īpatnējā aktivitāte un tīrība ir zemāka nekā piedāvātajā metodē.

Šo metodi var izmantot peroksidāzes rūpnieciskajā ražošanā no mārrutku saknēm.

PRETENZIJA

1. Metode peroksidāzes enzīma iegūšanai no mārrutku saknēm, ieskaitot diedzētu mārrutku sakņu sasmalcināšanu un homogenizāciju, mārrutku sakņu homogenāta ekstrakciju, balasta proteīnu atdalīšanu un peroksidāzes izgulsnēšanu ar amonija sulfāta sāļiem, peroksidāzes šķīduma gēla filtrēšanu uz Sephadex, hromatogrāfijas attīrīšana uz karboksimetilcelulozes, mērķa peroksidāzes liofilizēšana, atšķiras ar to, ka sasmalcinātās mārrutku saknes ekstrahē ar 0,15±0,01 M nātrija hlorīda šķīdumu; peroksidāzes šķīduma gēlfiltrāciju veic uz Sephadex G-100, dialīzi pret nātrija acetāta buferšķīdumu ar pH 4,4-5,0 un dialīzi pret kālija fosfāta buferšķīdumu ar pH 8,0±0,1 un koncentrēšanu ar papildu attīrīšanu uz DEAE -celulozes eluēšanas. ar to pašu buferšķīdumu, kam seko dialīze pret dejonizētu ūdeni.

2. Paņēmiens saskaņā ar 1. punktu, kas raksturīgs ar to, ka sasmalcinātās mārrutku saknes ekstrahē ar 0,15 ± 0,01 M nātrija hlorīda šķīdumu ar pH 4,4 ± 0,2.

3. Paņēmiens saskaņā ar 1. punktu, kas raksturīgs ar to, ka proteīnu izgulsnēšana ar amonija sulfāta sāļiem tiek izmantota divas reizes: balasta proteīnu atdalīšanai izmanto 45-48% piesātinājumu, bet peroksidāzes izgulsnēšanai izmanto 85-90% piesātinājumu.

4. Metode saskaņā ar 1. punktu, kas raksturīga ar to, ka gēla filtrēšanu veic uz Sephadex G-100, eluējot ar 0,15-0,2 M nātrija hlorīda šķīdumu ar pH 4,4-5,0.

5. Paņēmiens saskaņā ar 1. punktu, kas raksturīgs ar to, ka pirms peroksidāzes hromatogrāfiskās attīrīšanas uz karboksimetilcelulozes tiek veikta dialīze pret nātrija acetāta buferšķīdumu ar pH 4,4-5,0.

6. Paņēmiens saskaņā ar 1. punktu, kas raksturīgs ar to, ka pirms žāvēšanas liofilizē peroksidāzes šķīduma dialīze pret dejonizētu ūdeni.

"uzlauzta" disertācija

Man nebija jāmeklē tēma. Visa viņa bērnība bija saistīta ar mārrutkiem. Ciema vecmāmiņām nebija tablešu. Veselību laboja dabas veltes. Un, tiklīdz sniegs nokusa, viņi devās uz dārzu, lai raktu dziedinošo sakni. Pats rakstīja un "uzlauza" savu diplomdarbu.

Nodomāju, ka nolaizīju saldo krējumu, neatklājot būtību. Attiecībā uz lauksaimniecības tehnoloģijām es palaidu garām kaut ko svarīgu, - zinātnieks skaidro savu neparasto rīcību.

Tiecoties pēc patiesības, viņš sprieda apmēram šādi. Mārrutku dzimtenē, Krievijā, 60 gadus tas praktiski tika norakstīts. No 500 pastāvošajām šķirnēm palika tikai 2-3. Un Eiropā, kur tas parādījās pirms 200 gadiem, šodien ir 2,5 tūkstoši šķirņu. Amerikā, kur to ieveda 1900. gadā pēc Zemkopības ministrijas iniciatīvas, ir jau 3,5 tūkst. Un darbs pie tā audzēšanas turpinās. Priekš kam?

Izraēlā noplūda pirmā daļēji slēptā informācija, ka mārrutku zāles var izārstēt vēzi. Vēlāk Amerika un Eiropa "iedegās". Es vērsos pie zinātniekiem no FMD institūta un Mikrobioloģijas institūta. Viņi atšifrēja zāļu formulu - peroksidāzi. No tonnas mārrutku biezenī ieguva tikai pusgramu. Viņš sāka mocīt, it kā viņu "sajustu" un redzētu, - stāsta Emelīna.

Bija pareizi lietā iesaistīt skautus. Un tā arī notika. Ar viņu palīdzību mēs atradām franču uzņēmumu, kas tirgoja mūsu eļļu. Noklikšķināja. Viņi solīja uzcelt rūpnīcu peroksidāzes ražošanai. Bet tā ražošanas tehnoloģija palika zem atslēgas.

Tieši no lauka, lai vērtīgākajam nepaspētu pazust, sovhoza mārrutki tika nosūtīti analīzei uz laboratoriju Francijā. Analīze aizkavējas. Nosūtīts otrreiz.

Un izrādījās, ka mūsu mārrutkos peroksidāzes saturs ir 50 reizes lielāks nekā importētajos. Tas ir, no vienas tonnas mēs varam iegūt nevis 0,5 gramus, bet 25 gramus. "Jūs izaudzēsiet vismaz 30 tūkstošus mārrutku šķirņu, bet tādus, kādi mums ir Krievijā, jūs nekad nesaņemsit. Tas ir mūsu īpašums," toreiz triumfēja Emelīna.

Izrādījās, ka mūsu mārrutkos peroksidāzes saturs ir 50 reizes lielāks nekā ievestajos.

Un joprojām notika viņa disertācijas par mārrutkiem aizstāvēšana. Zinātniskā padomniece bija Marina Vladimirovna Aleksejeva, Balašihas Lauksaimniecības institūta profesora Ivana Vladimiroviča Mičurina studente. Pretinieki ir dārzeņkopības spīdekļi, kuri diez vai ticēja, ka kāds kolhoznieks no Vladimira iekšzemes piešāvās par šādu tēmu. Aizstāvēšanas rezultāts bija mārrutku rūpnieciskās audzēšanas rokasgrāmata. Tikmēr zinātnieki no diviem Vladimira, FMD un Virusoloģijas institūtiem, kuriem Emelins piegādāja izejvielas no savas saimniecības, izveidoja tehnoloģiju mājas peroksidāzes ražošanai.

Mēs bijām uz rūpnieciskās ražošanas robežas vielai, kuras cena pasaules tirgū sasniedza 7000 dolāru par gramu. Ja pirms 100 gadiem suzdālieši ļoti izdevīgi tirgojās ar Vāciju, gadā nosūtot uz turieni 40 vagonus mārrutku sakņu, tad šī tehnoloģija varētu kļūt par valsts zelta raktuvi, – ir pārliecināts Jurijs Anatoļjevičs.

Bet sākās perestroika, un valstij nebija laika ellei. Zinātniskā izpēte tika ierobežota, un tās rūpnieciskās audzēšanas apjoms tika samazināts līdz vienam laukam Stavrovskas sovhozā, kura direktors līdz tam laikam bija Emelins.

Dārza čūska Gorynych

Vai varbūt ir labi, ka viņi aprobežojās ar vienu jomu? - Es skaļi domāju, atceroties, cik grūti ar viņu cīnīties. Mārrutkus vajag dabūt dārzā, tos nekad neiznesīsi. Prātā nāk stāsts par slaveno mākslinieku un tagad arī gubernatoru Mihailu Evdokimovu par to, kā viņš mēģināja atbrīvoties no mārrutkiem, bet pat tols nepalīdzēja.

Ko tad darīt?

Tev nav ar viņu jācīnās. To var tikai pieradināt. Mārrutki labi sadzīvo ar sīpoliem, kartupeļiem un citām dārza kultūrām un pasargā tos no kaitēkļiem. To jau sen ir atzīmējuši mūsu senči. Vēl pirms 500 gadiem viņi teica: dārzs bez mārrutkiem ir kā ganāmpulks bez gana. Un, kad sāka dārzus, vispirms noteica mārrutku augšanas vietu.

Nav nejaušība, ka Suzdales zemē bija mārrutku un sīpolu stādījumi. Vispirms viņi izņēma sīpolu un pēc tam mārrutkus. Tas pats ar kartupeļiem. Septembrī viņi to izraka, un oktobrī parādījās mārrutki. Sējām kviešus un rudzus. Un viņi saņēma 50–60 centnerus par hektāru, - stāsta Emelīna.

Studējot mārrutkus, Emelīna nonāca "arheoloģiskajos" izrakumos. Vietā, kur viņš uzauga, viņš sijāja zemi un skaitīja saknes. Un viņš secināja, ka ir divu veidu mārrutki. Sakņojies 15 metru dziļumā, viņš sauca māti. Veidojas augšējā augsnes slānī no mazām saknēm, kas palikušas pēc ražas novākšanas - jāšanas.

Īstie mārrutki - mātes. Viņš izņem no zemes dzīļu slāņiem, tā sauktās Ādama zemes, tās barības vielas un elementus, kuru šeit vairs nav. Bet mārrutku nezāle var kļūt arī mātes. Dodiet tam laiku, jo gada laikā tas nonāk zemē par 60-70 cm.

Vai mārrutku "inficēšanās" ir diezgan iespējama? – Es izsaku bažas Emelīnai. Un atbildē viņš piedāvā jaunu argumentu:

Mārrutki ir pašregulējoša kultūra. Tāpat kā vienā tukšā mucā nevar ieliet divas mucas ūdens, tā arī uz viena zemes gabala neizaugs vairāk, nekā vajadzētu.

Un cik pienākas?

Tā raža ir maksimāli 4-5 tonnas sakņu no hektāra. Šāds krass ražības ierobežojums mārrutkus atšķir no citām kultūrām. Es to saku ar pilnu atbildību kā cilvēks, kurš ir veltījis vairāk nekā 30 gadus, lai to pētītu. Bet, ja viņš apmetās, tad gadsimtiem ilgi. Uz zemes, kur audzē mārrutkus, tie piedzims pēc 100 un pat 300 gadiem.

Tātad, Mihailam Evdokimovam ir taisnība un tikai kodolbumba viņu glābs? – Es turpinu argumentu visu dārznieku vārdā.

Vai jūs pēc ābolu novākšanas nenocirsīsiet ābeli? Nākamgad viņa dos ražu. Tas pats ar elli. Kādreiz raka tajā mēnesī, kura nosaukumā ir burts "r": septembris, oktobris, novembris (pārējā laikā nav tā asuma un sinepju smaržas) ... Nogriež augšpusi. cik vien iespējams, un līdz nākamajai sezonai šī vieta pieaugs vēl vairāk.

Kad Krievijā runāja par čūsku Goriniču, kurā vienas nogrieztas galvas vietā aug trīs galvas, iespējams, viņi domāja mārrutkus, ”skaidro Emelina.

Paskaties uz sakni

SPK "Stavrovsky" ir viena no retajām vietām Krievijā, kur var redzēt ziedošu mārrutku lauku. Un viņi saka, ka bites lido pār to dienām. Tiesa, sūdains medus režisoram nebija jāēd. Bet viņš uzdāvināja ziedus. Viņi, Emelina uzskata, ir neparasti skaisti.

Un veidojas mārrutku sēklas. Bet, ja tos iesēsi, nekas nesanāks. Mārrutki vairojas tikai ar sakņu palīdzību – veģetatīvi. Kāpēc? Jemelins neatrada atbildi. Taču, no otras puses, šis ir viens no momentiem, kas ļauj zinātniekam aizdomāties par tā seno izcelsmi. Pārdzīvojis spēcīgākās kataklizmas, augs acīmredzot pielāgojās un izdzīvoja šādā veidā.

Precīzas atbildes joprojām nav: vai tas ir dārzenis, ārstniecības augs vai garšviela? Skaidru sugu robežu trūkums, pēc Emelina domām, ir arī apstiprinājums hipotēzei, ka mārrutki ir Atlantīdas vēstnesis.

Daudzu kultūru izcelsme ir zināma jau sen. No kurienes mārrutki radušies, zinātnē ir daudz neskaidrību. Daudzos avotos lasīju, ka Tutanhamona laikā ēģiptieši kaut kur paņēma zelta vērtu sakni no barbariem. Bet man nav stingras pārliecības, ka tas ir mārrutki, ”neslēpj Emelīna.

Bet, dievišķojot sava pētījuma priekšmetu, viņš paliek praktiķis. Apceļojis selekcijas materiālu ap 250 Vladimira un Jaroslavļas apgabalu sakņu dārziem, viņš izstrādāja jaunu mārrutku šķirni - "Tolpukhovsky" (pēc savas saimniecības centrālā īpašuma nosaukuma) un iestādīja tās stādījumu stāvajā krastā. Kolokšas upe. Saka: līdz nākamajai civilizācijai.

Pats Emelīns mārrutkus lieto kā zāles. Bet atšķirībā no mums, neizglītotajiem, tas ņem vērā, ka mārrutku biezenī derīgās īpašības saglabājas tikai 7 dienas.

Mārrutkos, kas mēnešiem ilgi "karājas" veikalu plauktos, un mūsu pieliekamajos nav ne lāga! - saka zinātnieks.

Ko darīt?

Viņi rudenī izraka 5-6 kilogramus no zemes, ielika pagrabā, apkaisīja ar zemi un ļāva gulēt. Nedaudz izkāpiet no turienes, lai pietiktu 250 gramu burciņai. To var lietot divas reizes gadā: ziemā un agrā pavasarī. Ziemā - no pagraba. Un pavasarī, kad zeme ir nedaudz atkususi, var droši izrakt, līdz lapas izaug līdz 5 centimetriem. Tā darīja arī mūsu senči, kuri Lieldienās ēda cūku ar svaigiem mārrutkiem.

Emelīnai var uzticēties. Nesen viņš laida klajā trīs grāmatas pēc kārtas: "Drādieties savā dārzā", "Izdrādieties ar savu ārstu" un "Izdrādieties uz jūsu galda". Tagad viņš gatavojas publikācijai "Hrenolechebnik". Un viņš turpina atspēkot stereotipu, ka sūkāt nozīmē sliktu.

Vai varbūt tiešām, kad mēs sakām, ka dzīve ir pilnīgi bezvērtīga, ar to tiek domāts tikai krievu mārrutku liktenis?

Aptuveni 44 173,9 Da ir glikoproteīns, un tajā ir četri lizīna aminoskābju atlikumi, kas saistīti ar marķējamās molekulas.

Mārrutku peroksidāzes aktivitātes produkts ir krāsains vai luminiscējošs savienojums, kas piemērots noteikšanai un kvantitatīvās noteikšanai. HRP bieži izmanto kā daļu no konjugātiem noteiktu molekulu noteikšanai. Piemēram, Western blotēšanas gadījumā HRP konjugātus izmanto ar antivielām pret mērķa proteīniem vai molekulām; šajā gadījumā antivielai ir specifiskums noteiktam mērķim, un HRP veido nosakāmu signālu. . Mārrutku peroksidāzi izmanto arī tādās metodēs kā ELISA un imūnhistoķīmiskā analīze.

Mārrutku peroksidāze ir ideāls ferments daudziem lietojumiem, jo ​​tas ir salīdzinoši mazs, relatīvi stabils un lētāks nekā alternatīvas, piemēram, sārmaina fosfatāze. HRP ir b par lielāku apgriezienu skaitu laika vienībā un līdz ar to nodrošina pietiekami spēcīga signāla attīstību salīdzinoši īsā laika periodā.

Mārrutku peroksidāzei brīvā formā vai konjugātu veidā ar citām molekulām ir nepieciešams substrāta klātbūtne attēlveidošanai. HRP oksidē substrātu ūdeņraža peroksīda klātbūtnē, radot produktus, kurus var noteikt spektrofotometriski.

Tirdzniecībā pieejami mārrutku peroksidāzes substrāti 3,3',5,5'-tetrametilbenzidīns TMB) un 3,3"-diaminobenzidīns (ang. DAB) oksidējot iegūst krāsainus produktus, un ķīmiski luminiscējošās vielas SuperSignal, ECL ir nosakāmas gaismas avoti HRP iedarbībā.

Ķīmiluminiscences uzlabošana (ECL)

Mārrutku peroksidāze katalizē luminola oksidēšanos par 3-aminoftalātu, izmantojot virkni starpproduktu. Šo reakciju pavada zemas intensitātes mirdzums ar viļņa garumu 428 nm. Atsevišķu vielu klātbūtnē ir iespējams panākt luminiscences pieaugumu līdz pat tūkstoš reizēm. Luminiscences pastiprināšanas fenomenu sauc par hemiluminiscences pastiprināšanu. uzlabota hemiluminiscence, ECL ). Visefektīvākie pastiprinātāji ir fenolu atvasinājumi, piemēram, p-jodfenols. ECL ļauj noteikt aptuveni 0,5 pikogrammas nukleīnskābes Southern blotēšanas laikā.

Piezīmes

arejas saites

Wikimedia fonds. 2010 .

Skatiet, kas ir "mārrutku peroksidāze" citās vārdnīcās:

mārrutku peroksidāze- — Biotehnoloģijas tēmas LV mārrutku peroksidāze … Tehniskā tulkotāja rokasgrāmata

- [[Attēls:|px|Tireooperoksidāzes ķīmiskā struktūra]] vairogdziedzera peroksidāze Simbols(-i) TPO Entrez ... Wikipedia

Western blot analīze proteīniem, kas atdalīti ar gradienta poliakrilamīda gēla elektroforēzi SDS klātbūtnē. Western blotēšana (proteīna imūnblots, angļu Western blot) ir analītiska metode, ko izmanto, lai noteiktu ... ... Wikipedia

Western blot (Western blot, protein immunoblot, angļu Western blot) ir analītiska metode, ko izmanto, lai noteiktu specifiskus proteīnus paraugā. Pirmajā posmā tā izmanto proteīnu elektroforēzi poliakrilamīda gēlā, lai ... ... Wikipedia

- (angliski Peroxiredoxins, Prxs, EC 1.11.1.15) plaši izplatīta antioksidantu enzīmu saime. Zīdītājiem šīs grupas fermenti kontrolē citokīnu izraisīto peroksīdu līmeni, kas iesaistīti šūnu signalizācijā. … … Vikipēdija

Glutationa peroksidāze (GP) ir enzīmu grupa, kas aizsargā organismu no oksidatīviem bojājumiem. Ģimenes ārsti katalizē lipīdu peroksidāžu un ūdeņraža peroksīda sadalīšanos. Ir zināmi vairāki gēni, kas kodē dažādas glutationa peroksidāzes formas, kas atšķiras ... ... Wikipedia

Peroksidāze ir viens no visizplatītākajiem fermentiem, kas atrodami augos, mikrobios un dzīvnieku audos. Šis enzīms katalizē dažādu organisko savienojumu oksidēšanu ar ūdeņraža peroksīdu, veidojot toksiskus peroksīdus, kas tiek izvadīti no dzīviem organismiem. Peroksidāze ir glikoproteīns, kas sastāv no polipeptīdu ķēdes, kas veido divu domēnu globuli, un hēmu protēžu grupu ar dzelzs atomu, kas atrodas starp domēniem.

Galvenā atšķirīgā iezīme mārrutku peroksidāzes C struktūrā, salīdzinot ar citām augu peroksidāzēm, ir 34 aminoskābju atlikuma klātbūtne starp fenilalanīna (F) un glicīna G atlieku spirālēm (1. att.). Šis reģions, kas ir daļa no substrāta piekļuves kanāla, nav atrodams citu klašu peroksidāzēs, turklāt tas atšķiras pat savā klasē. Mārrutku peroksidāzei C, kam raksturīgs lielāks F-G ieliktnis (ar 7 aminoskābju atlikumiem), ir identificēts galvenais atlikums, kas spēj tieši mijiedarboties ar aromātiskām donoru molekulām. Mārrutku peroksidāzes izoenzīms C ir unikāls ar to, ka tam ir trīs perifēro atlikumu gredzens Phe142, Phe68 un Phe179, kas aizsargā pieeju atklātajai hēma malai. Šis aromātiskais reģions ir svarīgs, lai realizētu peroksidāzes spēju saistīt aromātiskos substrātus.

Rīsi. 1. Mārrutku peroksidāzes C telpiskā struktūra.

Peroksidāzes katalīzes procesu iezīme ir vairāku spektrofotometriski atšķiramu kompleksu veidošanās. Vienkāršota peroksidāzes cikla diagramma ir šāda:

E + H2O2 → E 1; k 1

E 1 + AH 2 → E 2 + AH; k2

E 2 + AH 2 → E + AH; k 3

kur E, E 1 , E 2 - attiecīgi sākotnējā peroksidāze un tās oksidētās formas; AN 2 , AN - attiecīgi sākotnējais substrāts un tā oksidētā forma.

Pirmā posma produkts E 1 , kas veidojas, ūdeņraža peroksīdam iedarbojoties uz fermentu, ir oksidēts peroksidāzes atvasinājums, kas satur divus oksidācijas ekvivalentus. E 1 formā dzelzs formālais lādiņš ir +4. Papildu oksidatīvais ekvivalents E 1 molekulā ir lokalizēts vai nu uz porfirīnperoksidāzes makrocikla, vai vienā no fermenta funkcionālajām grupām.

Donoru substrāti var reducēt E 1 savienojumu tieši līdz dabiskajam enzīmam (divu elektronu reducēšana) vai veidojot E 2 starpproduktu (viena elektrona reducēšana).

Peroksidāzes oksidācijas reakcijā papildus ūdeņraža peroksīdam kā oksidētājs (pirmais substrāts) var darboties organiskie substrāti, piemēram, alkilhidroperoksīdi, peroksibenzolskābes utt.. Peroksidāzei ir mazāka specifika attiecībā pret otro substrātu, tāpēc , vairākus elektronus ziedošus savienojumus var izmantot kā peroksidāzes substrātus un būt par pamatu noteikšanas sistēmām analītiskās bioķīmijas un klīniskās medicīnas metodēs.