• Спеціальність ВАК РФ03.00.23
• Кількість сторінок 106

ІІ. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ.

Глава 1. СТРУКТУРА, МЕХАНІЗМ ДІЇ І НОВІ ЗАСТОСУВАННЯ НАТИВНИХ І РЕКОМБІНАНТНИХ ПЕРОКИДАЗ.

1.1. Вступ.

1.2. Кристалічні структури пероксидаз.

1.3. Кислотно-основний каталіз пероксидаз.

1.4. Метал-зв'язувальні сайти.

1.5. Архітектура активного центру ПХ.

1.5.1 Структура дистальної області ПХ та система водневих зв'язків.

1.5.2. Структура проксимальної області ПХ та система водневих зв'язків.

1.5.3. Сайт зв'язування ароматичних субстратів.

1.6. Роль білкового оточення у пероксидазному каталізі.

Глава 2. БІОТЕХНОЛОГІЧНІ ЗАСТОСУВАННЯ ПЕРОКСИДАЗ.

2.1 Використання пероксидаз в)й1ушуноферментном аналізі.

2.2. Біохімічний аналіз фізіологічно активних речовин.

2.3. Використання пероксидаз у біосенсорах.

2.4. Застосування пероксидаз у біотрансформаціях.

2.5. Використання пероксидаз для біовідбілювання у целюлозно-паперовій промисловості.

Глава 3. ВИДІЛЕННЯ, РЕНАТУРАЦІЯ ТА ОСВІТА

ДИСУЛЬФІДНИХ ЗВ'ЯЗКІВ ЕУКАРІОТИЧНИХ БІЛКІВ, ЕКСПРЕСОВАНИХ У КЛІТКАХ E.coli У ТІЛАХ ВКЛЮЧЕННЯ.

ІІІ. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА.

Глава 4. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ.

4.1. Реагенти.

4.2. Методи дослідження.

4.2.1 Клонування рекомбінантних форм ПХ.

4.2.2 Отримання рекомбінантного кон'югату ПХ з БПЗК.

4.2.3 Експресія рекомбінантної ПХ у клітинах E.coli.

4.2.4 Протоколи рефолдингу та очищення рекомбінантної ПХ.

4.2.5 Фізико-хімічні властивості рекомбінантних форм ПХ.

4.2.6 Адсорбційні та електрохімічні вимірювання.

4.2.7 Розрахунок структурних змін у мутантних формах пероксидази хрону.

IV. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ.

Глава 5. ЕКСПРЕСІЯ РЕКОМБІНАНТНОЇ ПЕРОКИДАЗИ ХРІНА

У КЛІТКАХ E.coli: ОПТИМІЗАЦІЯ СИСТЕМИ ЕКСПРЕСІЇ, РЕФОЛДИНГУ, РЕАКТИВАЦІЇ ТА ОЧИЩЕННЯ.

5.1. Експресія ПХ у периплазматичну ділянку клітин E.coli BL21(DE3).

5.2. Оптимізація системи рефолдингу ПХ з тіл включення при експресії в цитоплазматичну ділянку клітин E.coli BL21(DE3)pLysS.

5.3. Властивості рекомбінантної ПХС 6xHis на С-кінці.

5.4. Одержання та властивості мутантних форм ПХ.

Глава 6. АМПЕРОМЕТРИЧНІ СЕНСОРИ НА ОСНОВІ

РЕКОМБІНАНТНИХ ФОРМ ПХ.

6.1 Амперометричне визначення Н2О2.

6.2 Стабільність сигналу біосенсора.

6.3 Розробка біферментних біосенсорів.

Глава 7. ОТРИМАННЯ І ВЛАСТИВОСТІ РЕКОМБІНАНТНОГО КОН'ЮГАТУ

ПЕРОКИДАЗИ ХРІНА З БПЖК.

7.1 Клонування та експресія рекомбінантного кон'югату ПХ-БПЖК у клітинах E.coli.

7.2 Фізико-хімічні та імунологічні властивості рекомбінантного кон'югату ПХ-БПЗК.

V. ВИСНОВКИ.

Рекомендований список дисертацій

• Імуноферментний аналіз білка, що зв'язує жирні кислоти на основі рекомбінантних реагентів 2004 рік, кандидат хімічних наук Андрєєва, Ірина Петрівна

• Рекомбінантна пероксидаза тютюну: одержання та каталітичні властивості 2007 рік, кандидат хімічних наук Хушпульян, Дмитро Михайлович

• Створення та вивчення властивостей рекомбінантних білків людини з потенційним протипухлинним ефектом 2007 рік, кандидат хімічних наук Савватєєва, Людмила Володимирівна

• Конформаційні відмінності нативної та рекомбінантної форм ізоферменту С пероксидази хрону, що виявляються радіохімічними та кінетичними методами

• Вивчення організації фосфат-зв'язувальної області бактеріальних урідінфосфорілаз 2000 рік, кандидат біологічних наук Чеботаєв, Дмитро Володимирович

Введення дисертації (частина автореферату) на тему «Отримання, властивості та застосування рекомбінантної пероксидази хрону»

Подібні дисертаційні роботи за спеціальністю "Біотехнологія", 03.00.23 шифр ВАК

• Конформаційні відмінності нативної та рекомбінантних форм ізоферменту С пероксидази хрону, що виявляються радіохімічними та кінетичними методами 2002 рік, кандидат хімічних наук Чубарь, Тетяна Анатоліївна

• Рекомбінантні аналоги ацилази глутарил-7-аміноцефалоспоранової кислоти бактерії Brevundimonas diminuta 2009 рік, кандидат біологічних наук Закірова, Світлана Анатоліївна

• Отримання рекомбінантних білків західносибірських ізолятів Borrelia burgdorferi sensu lato та вивчення їх антигенних властивостей 2009 рік, кандидат біологічних наук Рябченко, Олександр Володимирович

• Підвищення протипухлинної активності цитокіну TRAIL шляхом зміни амінокислотного складу білка 2010 рік, кандидат біологічних наук Яголович, Ганна Валеріївна

• Використання бета-спірального домену та пептидил-пролив ізомерази для отримання фібрилярного адгезину бактеріофага Т4 2012 рік, кандидат біологічних наук Чупров-Неточин, Роман Миколайович

Висновок дисертації на тему «Біотехнологія», Григоренко, Віталій Георгійович

Список літератури дисертаційного дослідження кандидат хімічних наук Григоренко, Віталій Георгійович, 2001 рік

Зверніть увагу, наведені вище наукові тексти розміщені для ознайомлення та отримані за допомогою розпізнавання оригінальних текстів дисертацій (OCR). У зв'язку з чим у них можуть бути помилки, пов'язані з недосконалістю алгоритмів розпізнавання. У PDF файлах дисертацій та авторефератів, які ми доставляємо, таких помилок немає.

Спосіб передбачає подрібнення та гомогенізацію пророщених коренів хрону, екстракцію гомогенізату коренів хрону 0,15±0,01 М розчином хлориду натрію. Відокремлюють баластові білки і беруть в облогу пероксидазу солями сульфату амонію 45-48% насичення і 85-90% насичення відповідно. Гельфільтрацію розчину пероксидази здійснюють на сефадекс G-100 з елююванням 0,15-0,2 М розчином хлориду натрію. Хроматографічне очищення проводять на карбоксиметилцелюлозі. Здійснюють ліофільні сушіння цільової пероксидази. Проводять діаліз проти буфера натрію-ацетатного з рН 4,4-5,0 і діаліз проти калій-фосфатного буфера з рН 8,0±0,1. Здійснюють концентрування з додатковим очищенням на ДЕАЕ-целюлозі з елюцією тим же буфером з подальшим діалізом проти деіонізованої води. Спосіб дозволяє отримати пероксидазу з високою питомою активністю та високим виходом. Вихід пероксидази становить 2,52-3,50 г/кг коренів хрону, питома активність – 640-700 Е.А./мг білка. 5 з.п. ф-ли, 2 іл., 1 табл.

Малюнки до патенту РФ 2353652

Винахід відноситься до галузі біотехнології, а саме виробництва ферментів з рослинної сировини, і може бути використане для лабораторного і промислового виробництва ферменту пероксидази з коренів хрону для імунології та імунохімії в якості головної складової частини кон'югатів для імуноферментних аналізів.

Відомі різні способи отримання пероксидази з коренів хрону.

Відомий спосіб одержання пероксидази з коренів хрону, що включає гомогенізацію коренів хрону, екстракцію ферменту сольовим розчином, осадження ферменту солями сульфату амонію, гельфільтрацію, спиртове осадження, електрофорез, переосадження хлоридом амонію, фільтрацію через сефадекс і G-Деалюкс.

Основними недоліками даного способу є невисока активність та чистота отриманого продукту, а також складність його отримання та велика кількість стадій технологічного процесу.

Відомий також спосіб отримання пероксидази з коренів хрону, яким коріння хрону гомогенізують, потім екстрагують фермент водою і осаджують пероксидазу солями сульфату амонію з наступною гельфільтрацією [Пат. Угорщини 172872, C07G 7/022].

Недоліком даного способу є низький вихід та низька чистота ферменту.

Відомий спосіб [А.С. Болгарії 46675, C12N 9/08, 15.02.90], яким коріння хрону пророщують протягом 2-3 діб, потім гомогенізують і екстрагують фермент водою протягом доби. Водний екстракт центрифугують з наступним фракціонуванням білків солями сульфату амонію, потім сульфатаммонійний осад ферменту розчиняють у дистильованій воді і піддають ультрафільтрації на фільтрах "Міліпор" PTGC 000 05. До отриманого фільтрату додають 08 00 на 1 частину фільтрату і пропускають через колонку з іонообмінником ДЕАЕ-Сефадекс А-50, потім послідовно ультрафільтрують на Міліпор PTGC 000 05, РТНК 000 05, PTGC 000 05 і піддають ліофільній сушці.

Недоліком даного методу є недостатньо високий вихід пероксидази, висока трудомісткість та тривалість процесу.

Найбільш близьким є спосіб [Пат. РФ 2130070, C12N 9/08, 10.05.1999], в якому промиті водою коріння хрону зачищають на 1/3 маси в присутності 0,25% розчину харчової аскорбінової кислоти, що використовується як екстрагуючий розчин. Пероксидазу з очищення екстрагують протягом 1 год 0,25% розчином аскорбінової кислоти, потім екстракт фільтрують і центрифугують. До надосадової рідини додають 5% сульфіту натрію і витримують протягом 24 годин при кімнатній температурі для дозрівання ферменту. " Дозрілий " розчин ферменту концентрують на ультрафільтраційних волоконних апаратах з фільтрами, що мають діаметр пір менше 40 кДа. До сконцентрованого в 10 разів розчину додають сульфат амонію до кінцевого насичення 85-90%, центрифугують, осад розчиняють у десятикратному обсязі бідистильованої води і наносять на колонку, заповнену сефадексом G-25, елюцію проводять бидистильованою водою. Збирають фракції, що містять пероксидазу з величиною R Z >0,1. До зібраних фракцій додають сульфат амонію до насичення 85-90%, центрифугують, осад розчиняють у 3-кратному за обсягом кількості бідистильованої води та наносять на колонку для гельфільтрації, заповнену сефадексом G-50, елюцію проводять бидистильованою водою. Збирають фракції, що містять пероксидазу, з величиною R Z >0,5. Фракції змішують, дотитрують до рН 4,4 і піддають очищенню на карбоксиметилцелюлозі, елююють фермент в градієнті концентрацій від 5 мМ до 0,15 М ацетатного буфера (рН 4,4) (V=S-500 мл, R-500 мл). Збирають фракції з величиною R Z >2,7 та з концентрацією ферменту не менше 10 мг/мл. Фракції об'єднують, дотитрують до рН 5,0 та ліофільно висушують.

Недоліками даного методу є недостатньо висока чистота та активність та невеликі виходи пероксидази.

Винахід вирішує завдання створення промислового способу отримання пероксидази з коренів хрону, що дозволяє отримувати пероксидазу з високою чистотою, з питомою активністю і з високим виходом.

Поставлене завдання вирішується способом отримання ферменту пероксидази з коренів хріну, який включає подрібнення і гомогенізацію пророщених коренів хрону, екстракцію гомогенізату коренів хрону, відділення баластових білків і осадження пероксидази солями сульфату амонію, гельфільтрацію розчину пероксиду при цьому подрібнені коріння хрону екстрагують 0,15±0,01 М розчином хлориду натрію з рН=4,4±0,2; гельфільтрацію розчину пероксидази здійснюють на сефадексі G-100 з елююванням 0,15-0,2 М розчином хлориду натрію з рН 4,4-5,0, проводять діаліз проти натрій-ацетатного буфера з рН 4,4-5,0 та діаліз проти калій-фосфатного буфера з рН 8,0±0,1 та концентрування з додатковим очищенням на ДЕАЕ-целюлозі з елюцією тим же буфером з подальшим діалізом проти деіонізованої води.

Двічі використовують осадження білків солями сульфату амонію: для відділення баластних білків використовують 45-48% насичення, а для осадження пероксидази використовують 85-90% насичення,

Хроматографічному очищенню пероксидази на карбоксиметилцелюлозі передує діаліз проти натрій-ацетатного буфера з рН 4,4-5,0.

Ліофільному сушінню передує діаліз розчину пероксидази проти деіонізованої води.

На Фіг.1 наведено принципову схему виділення пероксидази з коренів хрону.

Коріння хрону відмивають під проточною водою і пророщують протягом 140-160 год. при температурі +25±1°С. Пророщене коріння подрібнюють і екстрагують 0,15 М розчином натрію хлориду протягом 12±2 год при постійному перемішуванні, потім центрифугують.

До супернатанту-1 (Фіг.1) при безперервному перемішуванні додають 16,7±0,05 кг (45-48% насичення) сульфату амонію, осад відокремлюють центрифугуванням, а до супернатанту-2 (Фіг.1), що утворився, додають ще 11 ,8±0,05 кг (85% насичення) сульфату амонію, осад (Фіг.1) відокремлюють центрифугуванням і розчиняють дистильованою водою до кінцевого об'єму 200±10 мл. Після центрифугування супернатант, що містить пероксидазу, наносять на колонку, заповнену сефадексом G-100, і елююють 0,15 М розчином натрію хлориду зі швидкістю 100 мл/год, в ході елюції відбирають фракції по 20 мл. У зібраних фракціях вимірюють R Z = D 408 /D 275 . Фракції, у яких R Z не менше 0,8, об'єднують і діалізують проти натрій-ацетатного буфера (рН 4,4±0,2) (буфер-1), потім знесолений розчин пероксидази нашаровують на колонку, заповнену карбоксиметилцелюлозою та врівноважену буфером-1 і елююють лінійним градієнтом 5 мМ - 0,1 М ацетатного буфера (рН 4,4±0,2) (V=S-0,5 л, R-0,5 л). У білкових фракціях вимірюють величину R Z . Фракції, в яких значення R Z не менше 2,5, об'єднують і діалізують проти калій-фосфатного буфера (рН 8,0±0,1) (буфер-2), віддіалізований розчин ферменту нашаровують на колонку, заповнену ДЕАЕ-целюлозою, та елююють буфер-2. Фракції, в яких значення R Z не менше 3,0, об'єднують і діалізують проти деіонізованої води, потім переносять у стерильну термостійку колбу, заморожують рідким азотом і сушать ліофільно до повного висихання препарату.

Істотними відмітними ознаками запропонованого способу одержання біологічно активних речовин є:

Використання гельфільтрації на сефадекс G-100 для максимально повного очищення пероксидази від низькомолекулярних домішок;

Діаліз проти натрій-ацетатного буфера (рН 4,4-5,0), що дозволяє знесолити розчин пероксидази та підготувати його до хроматографії на карбоксиметилцелюлозі;

Діаліз проти калій-фосфатного буфера (рН 8,0±0,1), що дозволяє перевести розчин пероксидази до оптимального буфера з оптимальним рН для нанесення на ДЕАЕ-целюлозу;

Іонообмінна хроматографія пероксидази на ДЕАЕ-целюлозі як прийом, що забезпечує не лише додаткове очищення, а й концентрування розчину ферменту.

Таким чином, нами пропонується новий підхід, що дозволяє здійснювати переробку коренів хрону з одержанням ферменту пероксидази високої чистоти та питомої активності.

Відмінність заявляється способу від найближчого аналога і прототипу полягає в наступному.

У способі, що заявляється, подрібнені корені хрону екстрагують 0,15±0,01 М розчином хлориду натрію з рН=4,4±0,2, тим самим досягається максимально повний перехід ферменту в розчин, і при цьому фермент не втрачає своєї активності.

В аналогу винаходу [Пат. РФ 2130070, C12N 9/08, 10.05.1999] пероксидазу з очищення (без гомогенізації!) екстрагують протягом 1 год 0,25% розчином харчової аскорбінової кислоти, що може позначатися на виході пероксидази, оскільки очищення не гомогенізуються, переходить у розчин далеко не повністю, при цьому екстракція протікає у кислих умовах, що може призвести до часткової інактивації ферменту. У прототипі винаходу [А.С. Болгарії 46675, C12N 9/08, 15.02.90] фермент з гомогенізату коренів хрону екстрагують водою, що також призводить до низького виходу пероксидази з гомогенізату розчин.

На відміну від аналога винаходу, де пероксидазу осаджують двічі 85-90% насиченням сульфатом амонію, і прототипу винаходу, де чотири рази проводять осадження білків солями сульфату амонію, в заявляється способі проводять відділення баластних білків 45-48% насичення % насиченням.

В аналогу та прототипі винаходу концентрування проводять методом ультрафільтрації, при цьому в аналогу винаходу ультрафільтрація передує сульфатаммонійному осадженню пероксидази, що призводить до великої ймовірності співосадження домішкових білків, а відповідно до більш низької чистоти кінцевого продукту. У способі, що заявляється, пероксидаза піддається концентруванню на іонообмінному сорбенті ДЕАЕ-целюлоза на заключній стадії технологічного процесу, що призводить і до додаткового очищення ферменту.

У заявляється способі гельфільтрацію проводять на сефадекс G-100 з елююванням 0,15±0,01 М розчином хлориду натрію (рН 4,4-5,0), що дозволяє повністю позбутися зеленого відтінку розчину пероксидази, обумовленого наявністю хлорофілу і споріднених сполук і речовин з меншим, ніж у пероксидази, розміром молекул. В аналогу винаходу гельфільтрацію проводять на сефадекс G-25, який по здатності затримувати домішкові частинки, враховуючи розмір молекули пероксидази (близько 40 кДа), поступається сефадекс G-100.

Сутність винаходу ілюструється наступними прикладами.

Приклад 1. Отримання грубого екстракту

50 кг коріння хрону відмивають під проточною водою і пророщують протягом 140-160 год при температурі +25±1°С. Пророщене коріння подрібнюють на лопатевому гомогенізаторі і заливають 50 л 0,15-0,2 М розчином натрію хлориду (рН 4,4±0,2). Екстрагують суспензію протягом 12±2 годин при постійному перемішуванні, потім центрифугують.

До супернатанту-1 об'ємом 60 л для відділення баластних білків при безперервному перемішуванні додають сульфат амонію до 45-48% насичення. (Під 100%-ним насиченням мається на увазі кількість солі, при додаванні якого розчин стає насиченим, а при подальшому додаванні солі розчин стає пересиченим, і сіль випадає в осад. Для розчинів з сульфатом амонію 100% насиченням є додавання та повне розчинення 70, 7 г сульфату амонію в 100 мл дистильованої води. Осад-1 відокремлюють центрифугуванням. Далі супернатант-2, що утворився, об'ємом 55 л для осадження пероксидази насичують сульфатом амонію до 85%, осад-2 відокремлюють центрифугуванням. Осад, що утворився,-2 розчиняють деіонізованою водою до кінцевого об'єму 200±10 мл, нерозчинний осад-3 відокремлюють центрифугуванням.

Гель-хроматографія на сефадекс G-100.

Розчин пероксидази наносять на колонку об'ємом 1 л заповнену сефадексом G-100. Елюцію ведуть 0,15-0,2 М розчином натрію хлориду (рН 4,4-5,0) зі швидкістю 100 мл/год, в ході елюції відбирають фракції по 20 мл. У зібраних фракціях вимірюють R Z = D 408 /D 275 . Фракції, у яких R Z не менше 0,8 об'єднують.

У збірник поміщають 5 л 5±0,1 мМ натрій-ацетатного буфера (рН 4,4-5,0) (буфер-1) та діалізний мішок з об'єднаними фракціями пероксидази. Діаліз ведуть при постійному перемішуванні протягом 24 годин тричі змінюючи буфер у збірнику.

Знесолений розчин ферменту нашаровують на колонку об'ємом 1 л, заповнену карбоксиметилцелюлозою та врівноважену буфером-1. Елюцію ведуть зі швидкістю 50 мл/год лінійному градієнті 5 мМ-0,1 М ацетатного буфера (рН 4,4±0,2) (V=S-0,5 л, R-0,5 л). У білкових фракціях вимірюють величину R Z . Фракції, у яких значення R Z не менше 2,5 об'єднують.

У збірник поміщають 5 л 20±0,1 мМ калій-фосфатного буфера (рН 8,0±0,1) (буфер-2) та діалізний мішок з об'єднаними фракціями ферменту. Діаліз ведуть аналогічно.

Концентруюча хроматографія на ДЕАЕ-целюлозі.

Розчин ферменту з рН 8,0±0,1 нашаровують на колонку об'ємом 300 мл, заповнену ДЕАЕ-целюлозою. Елюцію ведуть буфером-2 зі швидкістю 50 мл/год. Фракції, у яких значення R Z не менше 3,0 об'єднують.

У збірник поміщають 5 л деіонізованої води та діалізний мішок з розчином пероксидази. Діаліз ведуть аналогічно.

Ліофільна сушка.

Розчин пероксидази переносять у стерильну термостійку колбу, заморожують рідким азотом та ліофільно сушать до повного висихання препарату.

Приклад 2 (порівняльний)

У даному прикладі витримані умови отримання пероксидази по прототипу, але для покращення основних показників пероксидази змінені дві існуючі в прототипі стадії, а саме: для ультрафільтраційного концентрування розчину пероксидази використовують два типи колонок з порожнистими волокнами, на відміну від прототипу, де використовують один тип волокон, і дробове фракціонування білків солями сульфату амонію (як у заявляється способі).

Одержання грубого екстракту.

50 кг коренів хрону відмивають під проточною водою і зачищають на 1/3 частину маси в присутності 33,5 л 0,25% розчину аскорбінової кислоти, в якому отримані очищення витримують протягом 1 год для екстракції ферменту пероксидази. Далі екстракт центрифугують на проточній центрифузі та витримують протягом 24 годин для "дозрівання" ферменту.

Первинне очищення та концентрування.

В отриманий екстракт додають 1,7 кг (5% за вагою) сульфіту натрію і екстракт піддають концентруванню та первинному очищенню методом ультрафільтрації на установці з порожнистими полімерними волокнами УПВ-6, укомплектованої колонками з фільтрами, що мають розміри пор 60 кДа і 5 кДа. Принципова схема установки представлена ​​на Фіг.2, де показані відцентровий насос 1; передфільтр 2; колонка з волокнами, що мають розмір пор 60 кДа 3; колонка з волокнами, що мають розмір пор 5 кДа 4; фільтрат пероксидази 5; концентрований розчин пероксидази 6; фільтрат, що містить низькомолекулярні білки 7.

Фракціонування білків солями сульфату амонію.

До концентрату об'ємом 6 л відділення баластних білків при безперервному перемішуванні додають сульфат амонію до 45-48% насичення. Осад відокремлюють центрифугуванням. Далі супернатант, що утворився, об'ємом 5,7 л для осадження пероксидази насичують сульфатом амонію до 85%, осад відокремлюють центрифугуванням, який розчиняють бидистиллированной водою до кінцевого об'єму 200±10 мл, нерозчинний осад відокремлюють центрифугуванням.

Гель-хроматографія на сефадекс G-25 і G-50.

Подальше очищення пероксидази проводять на колонці для гельфільтрації, заповненої сефадексом G-25 і врівноваженою водою, що бідистилює. Розчин пероксидази наносять на колонку, елюювання проводять бидистильованою водою. Збирають фракції, у яких R Z не менше 0,2. До зібраних фракцій додають сульфат амонію до 90% насичення, перемішують до повного розчинення солі та центрифугують. Осад розчиняють у 3-кратній за обсягом кількості бідистильованої води і наносять на колонку для гельфільтрації, заповнену сефадексом G-50 і врівноважену водою, що бідистилює. Елюювання проводять бидистильованою водою. Збирають фракції, у яких R Z не менше 0,6. За допомогою 50% оцтової кислоти значення рН у фракціях пероксидазою встановлюють на рівні 4,4.

Хроматографія на карбоксиметилцелюлозі.

Фракції пероксидази нашаровують на колонку об'ємом 1 л заповнену карбоксиметилцелюлозою, попередньо врівноважену 5 мМ ацетатним буфером з рН 4,4. Елюювання проводять лінійним градієнтом 5 мМ-0,15 М ацетатного буфера (рН 4,4±0,2) (V=S-0,5 л, R-0,5 л) протягом 1 години. У білкових фракціях вимірюють величину R Z . Фракції, у яких значення R Z не менше 2,7 об'єднують, встановлюють рН 5,0 додаванням аміаку і ліофільно висушують.

Порівняльні дані з прикладу 1 і 2 наведені в таблиці.

Таким чином, як видно з прикладів і таблиці, спосіб отримання пероксидази з коренів хрону (приклад 1) дозволяє отримувати пероксидазу з високими виходами, з чистотою і активністю, достатньою для використання даного ферменту в якості складової частини кон'югатів для імуноферментних аналізів. А в умовах прототипу (приклад 2) навіть при вдосконаленні двох стадій, що покращують показники, вихід, питома активність і чистота цільової пероксидази нижче за аналогічні показники заявляється способу.

Даний спосіб може бути використаний у промисловому одержанні пероксидази з коренів хрону.

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб отримання ферменту пероксидази з коренів хрону, що включає подрібнення і гомогенізацію пророщених коренів хрону, екстракцію гомогенізату коренів хрону, відділення баластових білків і осадження пероксидази солями сульфату амонію, гельфільтрацію розчину пероксидази на се, тим, що подрібнене коріння хрону екстрагують 0,15±0,01 М розчином хлориду натрію; гельфільтрацію розчину пероксидази здійснюють на сефадексі G-100, проводять діаліз проти натрій-ацетатного буфера з рН 4,4-5,0 і діаліз проти калій-фосфатного буфера з рН 8,0±0,1, та концентрування з додатковим очищенням на ДЕАЕ -целюлозі з елюцією тим же буфером з наступним діалізом проти деіонізованої води

2. Спосіб за п.1, який відрізняється тим, що подрібнене коріння хрону екстрагують 0,15±0,01 М розчином натрію хлориду з рН 4,4±0,2.

3. Спосіб за п.1, який відрізняється тим, що двічі використовують осадження білків солями сульфату амонію: для відділення баластних білків використовують 45-48% насичення, а для осадження пероксидази використовують 85-90% насичення.

4. Спосіб за п.1, який відрізняється тим, що гельфільтрацію проводять на сефадекс G-100 з елююванням 0,15-0,2 М розчином натрію хлориду з рН 4,4-5,0.

5. Спосіб за п.1, який відрізняється тим, що хроматографічного очищення пероксидази на карбоксиметилцелюлозі передує діаліз проти натрій-ацетатного буфера з рН 4,4-5,0.

6. Спосіб за п.1, який відрізняється тим, що ліофільному сушінню передує діаліз розчину пероксидази проти деіонізованої води.

"Зарубана" дисертація

Теми шукати не довелося. Все його дитинство було пов'язане з хроном. Пігулок у сільських бабусь не було. Здоров'я виправляли дарами природи. І щойно стояло сніг, йшли в город копати цілюще коріння. Написав і сам же свою дисертацію "зарубав".

Я подумав, що сметану злизав, не розкривши суті. За агротехнікою упустив щось головне, - пояснює вчений свій неординарний вчинок.

У гонитві за істиною він міркував приблизно так. На батьківщині хрону, у Росії, протягом 60 років його практично списали з рахунків. З 500 сортів, що існували, залишилося всього 2-3. А в Європі, де він з'явився 200 років тому, сьогодні 2,5 тисяч сортів. В Америці, куди його завезли 1900 року з ініціативи міністерства сільського господарства, вже 3,5 тисяч. І робота над його розведенням продовжується. Навіщо?

Перша напівзакрита інформація про те, що за допомогою препарату з хрону можна виліковувати рак, просочилася з Ізраїлю. Пізніше "засвітилися" Америка та Європа. Я звернувся до вчених із ящурного інституту та інституту мікробіології. Вони розшифрували формулу препарату – пероксидазу. З тонни протертого хрону його отримували лише півграма. Став чіплятися, як би його "помацати" і подивитися, - розповідає Ємелін.

Можна було підключати до справи розвідників. Так і сталося. З їхньою допомогою вийшли на одну французьку фірму, яка торгувала нашою нафтою. Натиснули. Ті пообіцяли поставити завод із випуску пероксидази. Але технологія її одержання залишалася під замком.

Прямо з поля, щоб не встигло зникнути найцінніше, радгоспний хрін відправили на аналіз до лабораторії до Франції. Аналіз загубився. Відправили вдруге.

І виявилося, що в нашому хроні вміст пероксидази в 50 разів вищий, ніж в імпортному. Тобто з однієї тонни ми можемо отримати не 0,5 г, а 25 грамів. "Ви хоч 30 тисяч сортів хрону виведете, а такого, як у нас у Росії, ніколи не отримаєте. Це наше надбання", - тріумфував тоді Ємелін.

Виявилося, що в нашому хроні вміст пероксидази в 50 разів вищий, ніж в імпортному.

А захист його дисертації про хрін таки відбувся. Науковим керівником була учениця Івана Володимировича Мічуріна, професор сільгоспінституту в Балашихі Марина Володимирівна Алексєєва. Опонентами - корифеї овочівництва, які важко вірили, що якийсь колгоспник з володимирської глибинки замахнувся на таку тему. Підсумком захисту став методичний посібник з промислового вирощування хрону. Тим часом вчені двох володимирських інститутів, ящурної та вірусології, яким Ємелін постачав сировину зі свого господарства, створили технологію отримання вітчизняної пероксидази.

Ми стояли на порозі промислового отримання речовини, ціна якої на світовому ринку сягала 7 тисяч доларів за грам. Якщо 100 років тому суздальці дуже вигідно торгували з Німеччиною, відправляючи туди по 40 вагонів коріння хрону на рік, то ця технологія могла стати для країни золотим дном, - переконаний Юрій Анатолійович.

Але почалася перебудова і країні було не до хрону. Наукові дослідження згорнули, а масштаби його промислового вирощування скоротилися до одного поля в радгоспі "Ставрівський", директором якого на той час став Ємелін.

Огородний Змій Горинич

А може, й добре, що обмежились одним полем? - гадаю я вголос, згадуючи, як важко з ним боротися. Варто завестися хріну на городі, нізащо не виведеш. На думку спадає розповідь відомого артиста, а тепер і губернатора Михайла Євдокимова про те, як намагався позбутися хрону, але не допоміг навіть тол.

Що тоді робити?

А не треба з ним боротись. Його можна лише приручити. Хрін чудово вживається з цибулею, картоплею та іншими городними культурами та захищає їх від шкідників. Це давно помітили наші предки. Ще 500 років тому вони говорили: город без хріну, як череда без пастуха. А коли заводили городи, насамперед визначали місце, де зростатиме хрін.

Не випадково на суздальській землі були хріно-цибульні плантації. Спочатку прибирали цибулю, а слідом за нею хрін. Те саме і з картоплею. У вересні його викопали, а у жовтні підійшов хрін. Ми сіяли по хріну пшеницю, жито. І отримували по 50-60 центнерів із гектара, – розповідає Ємелін.

Вивчаючи хрін, Ємелін дійшов до "археологічних" розкопок. На ділянці, де той ріс, просіював землю та підраховував коріння. І зробив висновок, що існує хрін двох видів. Корінь, що йде на глибину до 15 метрів, він назвав материнським. Що утворився у верхньому шарі ґрунту з маленьких корінців, що залишилися після збирання, - верховим.

Істинний хрін – материнський. Він дістає з підґрунтових шарів, так званої адамової землі, ті поживні речовини та елементи, яких тут уже немає. Але й верховий хрін-бур'ян може стати материнським. Дай час, адже за рік він іде у землю на 60-70 см.

Значить, "зараження" хроном цілком імовірно? – висловлюю побоювання Ємеліну. А він у відповідь висуває новий аргумент:

Хрін – культура саморегульована. Як в одну порожню бочку не наллєш дві бочки води, так і на одній ділянці землі не виросте більше, ніж належить.

А скільки належить?

Його врожайність – максимум 4-5 тонн коріння з гектара. Таке різке обмеження рамками врожайності відрізняє хрін з інших культур. Це я говорю з повною відповідальністю як людина, яка присвятила її вивченню понад 30 років. Але якщо він оселився, то на віки. На землі, де вирощують хрін, народиться по 100 і навіть по 300 років.

Значить, має рацію Михайло Євдокимов і врятує від нього тільки ядерна бомба? - продовжую суперечку від імені всіх городників.

Ви ж не будете після того, як зібрали яблука, пиляти яблуню? Вона дасть урожай і наступного року. Так і з хроном. Раніше його копали в тому місяці, у назві якого є буква "р": вересень, жовтень, листопад (в решту часу в ньому немає тієї гостроти та гірчичного запаху)... Зріжете, на скільки можете, верхівку, а до наступного сезону на на цьому місці наросте ще більше.

Коли на Русі говорили про Змію Горинич, у якого на місці однієї зрізаної голови відростають три, то, напевно, мали на увазі хрін, - пояснює Ємелін.

Зри в корінь

СВК "Ставровский" - одне з рідкісних місць у Росії, де можна побачити поле квітучого хрону. І кажуть, бджоли над ним літають цілодобово. Щоправда, хрінового меду директору їсти не доводилося. А ось квіти дарував. Вони, вважає Ємелін, краси незвичайної.

І насіння у хрону утворюється. Але якщо їх посіяти, нічого не зійде. Хрін розмножується лише за допомогою коренів – вегетативно. Чому? Відповіді Ємелін не знайшов. Але це один з моментів, що дозволяє вченому думати про його найдавніше походження. Переживши найсильніші катаклізми, рослина, мабуть, таким чином пристосувалася та вижила.

Досі немає точної відповіді: овоч він, лікарська рослина чи пряність? Відсутність чітких видових кордонів теж, на думку Ємеліна, є підтвердженням гіпотези, що хрін - посланець Атлантиди.

Походження багатьох культур давно відоме. Звідки ж виник хрін, у науці велика плутанина. У багатьох джерелах я читав, що за Тутанхамона єгиптяни десь брали корінь на вагу золота у варварів. Але твердого переконання, що це саме хрін, я не маю, - не приховує Ємелін.

Але обожнюючи предмет своїх досліджень, він залишається практиком. Об'їхавши у пошуках селекційного матеріалу близько 250 городів Володимирської та Ярославської областей, вивів новий сорт хрону - "Толпухівський" (за назвою центральної садиби свого господарства) та посадив його плантацію на крутому березі річки Колокші. Каже: до наступної цивілізації.

Сам Ємелін вживає хрін як ліки. Але на відміну від нас, неосвічених, враховує, що корисні властивості у протертому хріні зберігаються лише 7 днів.

У хроні, який місяцями "бовтається" на магазинних прилавках, та й у наших коморах, немає ані хрону! - каже вчений.

Що ж робити?

Викопали із землі восени кілограмів 5-6, поклали у льох, присипали землею, і хай собі лежить. Діставайте звідти помалу, щоб вистачило на 250-грамову баночку. Його двічі на рік можна брати: взимку та напровесні. Взимку – із льоху. А навесні, трохи земля відтанула, можна сміливо викопувати доти, доки листочки не відростуть до 5 сантиметрів. Так робили наші предки, які на Великдень їли порося зі свіжим хріном.

Ємеліну можна вірити. Нещодавно він одну за одною випустив три книги: "Хрін у вашому городі", "Хрін ваш лікар" і "Хрін на вашому столі". Тепер готує до видання "Хрінолікар". І продовжує спростовувати стереотип, що хрінова - це означає погано.

А може, справді, коли в нас кажуть, що життя зовсім хронове, мають на увазі лише долю російського хрону?

Близько 44,173.9 Так, є глікопротеїд і має чотири залишки амінокислоти лізину для з'єднання з молекулою, яку потрібно позначити.

Продукт активності пероксидази хрону являє собою кольорову або люмінесцентну сполуку, що підходить для детекції та кількісного аналізу. HRP часто використовують у складі кон'югатів для детекції певних молекул. Наприклад, у разі вестерн блоту використовують кон'югати HRP з антитілами проти заданих білків або молекул; в даному випадку антитіло має специфічність до заданої мішені, а HRP утворює сигнал, що детектується. . Пероксидазу хрону також використовують у таких методиках, як ІФА та для імуногістохімічного аналізу.

Пероксидаза хрону є ідеальним ферментом для багатьох методик, оскільки має відносно невеликий розмір, відносно стабільна і дешевша, ніж альтернативи - наприклад, лужна фосфатаза. HRP має б обільша кількість оборотів в одиницю часу і тому забезпечує розвиток досить сильного сигналу за невеликий період часу.

Пероксидаза хрону у вільній формі або у вигляді кон'югатів з іншими молекулами потребує субстрату для візуалізації. HRP окислює субстрат у присутності пероксиду водню, при цьому утворюються продукти, які можна детектувати спектрофотометрично.

Комерційно доступні субстрати пероксидази хрону 3,3',5,5'-Тетраметилбензидин (англ. TMB) та 3,3"-Діамінобензідин (англ. DAB) при окисленні дають кольорові продукти, а хемілюмінесцентні речовини SuperSignal, ECL є джерелами світла, що детектується при дії HRP.

Посилення хемілюмінесценції (ECL)

Пероксидаза хрону каталізує окиснення люмінолу в 3-амінофталат через серію інтермедіатів. Ця реакція супроводжується світінням низької інтенсивності з довжиною хвилі 428 нм. У присутності деяких речовин, можна досягти посилення світіння до тисячі разів. Явище посилення світіння називають посиленням хемілюмінесценції (англ. enhanced chemiluminescence, ECL ). Найбільш ефективними підсилювачами є похідні фенолів, наприклад р-йодофенол. ECL дозволяє детектувати близько 0,5 пікограми нуклеїнової кислоти при Саузерн блот.

Примітки

Зовнішні посилання

Wikimedia Foundation. 2010 .

Дивитись що таке "Пероксидаза хрону" в інших словниках:

пероксидаза хрону- - Тематики біотехнології EN horseradish peroxidase … Довідник технічного перекладача

- [[Зображення:|px|Тиреопероксидаза chemical structure]] thyroid peroxidase Позначення Symbol(s) TPO Entrez … Вікіпедія

Вестерн блот - аналіз білків, розділених за допомогою градієнтного електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності SDS. Вестерн блоттінг (білковий імуноблот, англ. Western blot) аналітичний метод, що використовується для визначення ... Вікіпедія

Вестерн блот (вестерн блот, білковий імуноблот, англ. Western blot) аналітичний метод, що використовується для визначення специфічних білків у зразку. На першому етапі використовує електрофорез білків у поліакриламідному гелі для ... Вікіпедія

- (Англ. Peroxiredoxins, Prxs, КФ 1.11.1.15) широкопоширена сім'я антиоксидантних ферментів. У ссавців ферменти цієї групи контролюють рівень цитокін індукованих пероксидів, що у передачі клітинних сигналів. … … Вікіпедія

Глутатіонпероксидази (ГП) - сімейство ферментів, що захищають організм від оксидативного пошкодження. ДП каталізують розпад ліпідних пероксидаз та перекису водню. Відомо кілька генів, що кодують різні форми глутатіонпероксидаз, що відрізняються ... Вікіпедія

Пероксидаза - один із найпоширеніших ферментів, що міститься в рослинах, мікробах, тканинах тварин. Цей фермент каталізує окислення широкого спектра органічних сполук пероксидом водню з утворенням токсичних пероксидів, що видаляються з живих організмів. Пероксидаза є глікопротеїдом, що складається з поліпептидного ланцюга, що формує дводоменну глобулу, і гемової простетичної групи з атомом заліза, що розташовується між доменами .

Основною відмінною особливістю в структурі пероксидази С хрону в порівнянні з іншими рослинними пероксидазами є наявність ділянки довжиною 34 амінокислотних залишків між спіралями залишків фенілаланіну (F) і гліцину G (рис. 1). Ця область, яка є частиною каналу для доступу субстрату, не зустрічається у пероксидаз інших класів, навіть вона має відмінності навіть в межах свого класу. Для пероксидази С хрону, що характеризується більшою F-G-вставкою (на 7 амінокислотних залишків), ідентифікований ключовий залишок, здатний вступати в прямі взаємодії з донорними ароматичними молекулами. Ізофермент С пероксидази хрону унікальний тим, що має кільце з трьох периферійних залишків Phe142, Phe68 і Phe179, яке захищає підхід до краю гему, що піддається впливу. Ця ароматична сфера важлива для реалізації здатності пероксидази зв'язувати ароматичні субстрати.

Рис. 1. Просторова структура пероксидази C хрону.

Особливістю процесів пероксидазного каталізу є утворення ряду спектрофотометрично помітних комплексів. Спрощена схема пероксидазного циклу виглядає так:

Е + H 2 O 2 → E 1; k 1

E 1 + АH 2 → E 2 + АH; k 2

E 2 + АH 2 → Е + АH; k 3

де Е, Е 1 , Е 2 - відповідно вихідна пероксидаза та її окислені форми; АН 2 , АН - відповідно вихідний субстрат та його окислена форма.

Продукт першої стадії - E 1 утворюється при дії пероксиду водню на фермент, являє собою окислене похідне пероксидази, що містить два окислювальні еквіваленти. У Е 1 залізо має формальний заряд +4. Додатковий окисний еквівалент у молекулі Е 1 локалізується або на порфіриновому макроциклі пероксидази, або на одній з функціональних груп ферменту.

Донорні субстрати можуть відновлювати сполуку E 1 безпосередньо у нативний фермент (двоелектронне відновлення) або через утворення проміжної сполуки E 2 (одноелектронне відновлення).

У реакції пероксидазного окислення, крім пероксиду водню, в якості окислювача (першого субстрату) можуть виступати органічні субстрати - алкілгідропероксиди, пероксибензольні кислоти та ін. По відношенню до другого субстрату пероксидаза виявляє меншу специфічність, тому цілий ряд електронодонорних сполук бути основою детектуючих систем у методах аналітичної біохімії та клінічної медицини.